Неоспороз у собак: патогенез и лечение

Авторы: Rodrigo Silva, Gustavo Machado 

Неоспороз собак — это широко распространённое заболевание, вызываемое облигатным внутриклеточным паразитом Neospora caninum. Оно проявляется в основном неврологическими симптомами.

Neospora caninum имеет сложный жизненный цикл и может поражать множество теплокровных животных. Окончательным хозяином паразита являются домашние и дикие псовые. Они выделяют ооцисты после того, как проглатывают тканевые цисты, инфицированные промежуточными хозяевами (например, овцами, лошадьми, крупным рогатым скотом, собаками и многими другими видами), содержащие брадизоиты. Также они могут заразиться, употребляя воду и пищу, загрязнённую ооцистами.

Наличие собак на фермах считается фактором риска для продуктивных животных. В настоящее время существует множество диагностических методов, но наиболее распространённым является серология — непрямой флуоресцентный тест на антитела, который позволяет выявлять антитела в образцах сыворотки крови.

Вакцины от этого заболевания пока не разработано, поэтому стратегии борьбы должны быть направлены на предотвращение вертикальной и горизонтальной передачи паразита. Не рекомендуется кормить собак сырым или недостаточно термически обработанным мясом. Также следует уделять внимание качеству воды, которую пьют люди и животные. В настоящее время нет лекарств, способных контролировать передачу вируса через плаценту.

Биология паразита

Neospora caninum — это облигатный внутриклеточный паразит, который вызывает заболевание неоспороз у широкого круга теплокровных животных, включая домашних и диких. Неоспороз — это недавно возникшее заболевание, встречающееся во всём мире. Оно часто связано с репродуктивными проблемами, такими как неонатальная смертность у животных, особенно у собак и крупного рогатого скота, а также с неврологическими нарушениями, включая нервно-мышечную дегенерацию.

Заболевание имеет тенденцию к прогрессированию и более тяжело переносится молодыми животными. Для крупного рогатого скота оно считается одной из основных причин бесплодия, абортов и неонатальной смертности. У овец также могут возникать репродуктивные и неонатальные заболевания, однако экономическое значение Neospora caninum для овец менее очевидно по сравнению с крупным рогатым скотом.

В Норвегии учёные Bjerkås и коллеги диагностировали у семи щенков боксера заболевание, похожее на токсоплазмоз. Это ещё одно паразитарное заболевание из группы апикомплексов. У щенков были обнаружены тканевые кисты, похожие на Toxoplasma gondii, но без специфических антител.

Новый паразит был впервые классифицирован как N. caninum в США учёными Dubey и коллегами. Они выделили и описали заболевание, вызванное этим простейшим, у щенка с клиническими признаками, похожими на те, о которых сообщали Bjerkås с коллегами.

Позже этот простейший был признан возбудителем болезни у собак и идентифицирован у абортированных и мумифицированных плодов крупного рогатого скота, а также у телят с неонатальным параличом.

McAllister и коллеги определили домашнюю собаку (Canis lupus familiaris) как окончательного хозяина N. caninum, а Gondim и коллеги сообщили о койоте (C. latrans) как о диком окончательном хозяине паразита. Они подтвердили половую стадию паразита и выделение ооцист с фекалиями. Недостаток информации о распространении паразита значительно затруднил разработку действенных мер по профилактике и контролю инфекции.

Жизненный цикл N. caninum включает три основные стадии, которые играют ключевую роль в процессе заражения:

1. Спорозоиты в спорулированных ооцистах. Каждая спорулированная ооциста содержит две спороцисты, каждая из которых включает четыре спорозоита.
2. Тахизоиты — быстро делящиеся клетки, способные к быстрому размножению.
3. Брадизоиты — медленно размножающиеся клетки, которые находятся в тканевых кистах (табл. 1).

Ооцисты представляют собой устойчивую к внешним условиям стадию, выделяемую с фекалиями окончательного хозяина. Они способны выживать в окружающей среде в течение нескольких месяцев или даже лет.

Тканевые кисты имеют мощную стенку, которая защищает брадизоиты от агрессивной внеклеточной среды, возникающей в результате иммунного ответа хозяина. Эта форма паразита встречается преимущественно в мышцах и центральной нервной системе (ЦНС). Каждая тканевая киста может содержать от 20 до 100 брадизоитов.

Брадизоиты обладают высокой жизнеспособностью, способной сохраняться при температуре 4°C в течение более 14 дней. Они также устойчивы к перевариванию пепсином и трипсином. Тахизоиты свободно передвигаются в органических жидкостях и паразитофорной вакуоли (ПВ), которая находится в цитоплазме клетки-хозяина. Однако они очень уязвимы к внешним факторам и быстро теряют способность к инвазии.

Они способны активно проникать через мембраны самых разных ядросодержащих клеток, что говорит о низкой специфичности к клеткам-хозяевам. Тахизоиты размножаются путем эндодиогенеза и способствуют увеличению объема ПВ, что в итоге приводит к лизису клеток.

Таблица 1.

Структурные и морфологические особенности стадий Neospora caninum  

Таблица 2.

Дефинитивные и промежуточные хозяева при неоспорозе

Neospora caninum является гетероксенозным паразитом.  Собака (C. lupus familiaris) считается окончательным недиким хозяином паразита, в то время как койот (C. latrans) австралийский динго (C. lupus dingo) и серый волк (C. lupus) являются окончательными дикими хозяевами. Сообщалось о широком спектре промежуточных хозяев (Таблица 2). 

Многие аспекты жизненного цикла N. caninum остаются неизвестными, особенно это касается половой стадии развития паразита. Для полного понимания всего энтероэпителиального цикла и изучения взаимодействия между собакой и паразитом в условиях естественной, а не экспериментальной инфекции, необходимы дополнительные исследования.

Neospora caninum может передаваться двумя способами: вертикально и горизонтально. Вертикальная передача происходит на поздних сроках беременности, когда происходит трансплацентарная передача с инфицированием плода, или после рождения, когда тахизоиты передаются через молоко (трансмаммарная передача).

При горизонтальной передаче инфекция происходит после рождения, когда собака употребляет воду, содержащую спорулированные ооцисты, или инфицированные ткани, такие как сырое или недоваренное мясо, а также плодные оболочки промежуточных хозяев, у которых имеются тканевые кисты или они заражены спорулированными ооцистами. Фекальная передача (ооцистами), по-видимому, менее значима, чем плотоядность.

Когда спорулированные ооцисты или тканевые цисты попадают внутрь организма, они выводят свои цисты и высвобождают спорозоиты и брадизоиты, соответственно, в просвет двенадцатиперстной кишки. В эпителии кишечника эти микроорганизмы превращаются в тахизоиты, проходят фазу размножения, возможно, в брыжеечных лимфатических узлах, и достигают кровотока. Через кровь они распространяются в матку и различные типы клеток, включая клетки центральной нервной системы, эндотелиальные клетки сосудов, миоциты, гепатоциты, почечные клетки, альвеолярные макрофаги и трофобласты плаценты. Там они проникают внутрь клеток и начинают активно размножаться, вызывая серьезные поражения в пораженных тканях.

Если иммунная система хозяина активна, внеклеточная среда становится враждебной для паразита. В этом случае тахизоиты превращаются в брадизоитов и образуют тканевые кисты (бесполая стадия) у промежуточных хозяев, что свидетельствует о хронической стадии инфекции.

Рецидив заболевания, вызванный каким-либо супрессивным фактором, может привести к изменениям в иммунитете хозяина. Это может проявляться в виде иммуномодуляции или иммуносупрессии, а также в преобразовании брадизоитов в тахизоиты и разрыве тканевых кист. В результате высвобождаются брадизоиты, которые реактивируют инфекцию. Этот процесс, как известно, наблюдается у беременных животных, что может привести к внутриутробной инфекции.

У окончательных хозяев, тахизоиты превращаются в мерозоиты, то есть в макрогаметы и микрогаметы, в эпителии кишечника. В ходе мерогонии (полового процесса) они образуют зиготу.

Зиготы, или неспорулированные ооцисты, выделяются в просвет кишечника и с фекалиями хозяина попадают в окружающую среду. Их количество может достигать одного миллиона. Это происходит примерно через 20-25 дней после того, как они попали в организм.

Количество и продолжительность выделения ооцист могут значительно варьироваться в зависимости от количества проглоченных паразитов, состояния иммунитета хозяина и стадии развития паразита.

Неспорулированные ооцисты становятся спорулированными и заразными для перорального приема вне организма хозяина при благоприятных условиях окружающей среды: концентрации кислорода, влажности и температуре. Этот процесс занимает от 1 до 5 дней.

Неизвестна ни породная предрасположенность, ни различия в восприимчивости собак к неоспорозу в зависимости от пола. Однако возраст может быть фактором риска. После первичного контакта взрослые собаки выделяют меньше ооцист, чем щенки. У щенков также может наблюдаться ресекреция после повторного заражения.

При сообщении о случаях заражения и заболевания Neospora caninum необходимо учитывать несколько важных факторов. К ним относятся:

• Инфекционная форма паразита;
• Вирулентность штамма;
• Паразитарная нагрузка;
• Иммунный статус хозяина.

Neospora caninum может вызывать серьезные заболевания у крупного рогатого скота, собак, а иногда и у других животных.

Антитела к Neospora caninum были обнаружены у собак из разных частей света: Северной, Центральной и Южной Америки, Европы, Южной Африки, Азии и Океании. Частота встречаемости этих антител варьировалась от 5,8% (6 из 104) до 12,9% (21 из 163) в Англии, от 5,5% (19 из 344) до 23,6% (36 из 152) в Нидерландах, от 7,1% (14 из 198) до 31,3% (15 из 48) в Японии и от 0 до 19,2% в Чехии, в зависимости от того, как использовались эти собаки: 4,7% армейских, 0% полицейских, 2,6% частных и 19,2% собак из приютов.

Эти данные подчеркивают эпидемиологическую значимость неоспороза у собак и выделяют его как возможный дифференциальный диагноз в ветеринарных клиниках для собак с неврологическими заболеваниями. Паразит может оставаться в окружающей среде, где его окончательный хозяин выделяет ооцисты с фекалиями.

Вуда и его коллеги предположили, что совместное проживание собак и крупного рогатого скота на одной ферме может повысить риск заражения последнего. Однако ни Liu и его коллеги, ни Paiz и его коллеги не нашли подтверждения тому, что система выпаса является значимым фактором риска для коз.

Среди травоядных животных основной причиной абортов как у молочного, так и у мясного скота является N. caninum. Тем не менее, лактогенная передача также может иметь место и быть важной, согласно исследованиям 49 и 50. Для подтверждения этой теории необходимы дальнейшие исследования в естественных условиях на телятах или собаках.

Hietala and Thurmond, а также Davison et al. также обнаружили низкие уровни горизонтальной передачи паразита у крупного рогатого скота. Однако не стоит недооценивать значимость этого пути, особенно учитывая сохранение паразита в региональных стадах.

Во всем мире уровень серопревалентности (то есть, частота встречаемости антител) сильно различается у мясного, молочного скота и буйволов. У буйволов этот показатель составляет примерно 48%, по сравнению с 16,1% для молочного скота и 11,5% для мясного скота.

Этот высокий уровень серопревалентности варьируется от 1,5% (три из 200) в южном Вьетнаме и 3,8% (четыре из 105) на Филиппинах до 88% (169 из 192) в Бразилии и 88,3% (424 из 480) в Австралии.

В Южной Америке серопревалентность молочного скота колеблется от 10,62% (66 из 121) в Бразилии до 20,3% в Аргентине. Кроме того, Форт и др. отмечают, что риск заражения паразитом при горизонтальной передаче у молочного скота в Аргентине в 3,1 раза выше, чем у мясного скота.

Среди мелких жвачных животных распространённость заболевания варьируется в зависимости от региона и вида. Например, среди коз этот показатель варьировался от 0,4% (четыре случая из 1060) в Польше и 0,9% (четыре случая из 464) в Южной Корее до 19,7% (182 из 923) в Сан-Паулу, Бразилия, и 23,6% (21 из 89) на Филиппинах.

У овец же этот показатель варьировался от 0,6% (четыре случая из 640) в Новой Зеландии и 1,8% (семь случаев из 409) в Риу-Гранди-ду-Норти, Бразилия, до 59,2% (353 из 596) в Сан-Паулуи 63% (214 из 339) на севере Иордании.

Этот наблюдаемый сценарий согласуется с результатами исследований Nasir et al., Anastasia et al. и Liu et al., которые показали, что овцы более восприимчивы к инфекции N. caninum, чем козы. Кроме того, наличие собак и плохие условия гигиены являются важными факторами риска, способствующими заражению у этих видов.

Патогенез

Патогенез неоспороза определяется взаимодействием между способностью тахизоита проникать в клетки и размножаться внутри них, а также возможностями организма хозяина противостоять этому процессу.

Процесс проникновения в клетку включает два этапа: адгезию к поверхности клетки-хозяина и инвазию внутрь, которые могут длиться всего около 5 минут. Начальная стадия адгезии осуществляется через низкоаффинный контакт, который активирует выделение белков, содержащихся в микронеме. Это приводит к более специфичному присоединению к поверхности клетки-хозяина, и, наконец, к инвазии. Для успешного осуществления этого процесса необходимы соответствующие рецепторы на поверхности клетки-хозяина, которые обеспечивают достаточное количество сигналов для проникновения паразита в цитоплазму.

Чтобы начать процесс проникновения в клетку-хозяина, тахизоиты меняют свою ориентацию и становятся перпендикулярно мембране поверхности клетки. Затем они проникают внутрь, перемещаясь передним концом, пока не окажутся в цитоплазме, окруженной лизосомами.

Инвазия представляет собой активный процесс, требующий метаболической энергии только от паразита, но не от клетки-хозяина.

Тахизоиты Neospora caninum взаимодействуют с клеткой-хозяином с помощью высококонсервативных апикомплексных механизмов. В отличие от других родов, Neospora caninum способна распознавать один или несколько рецепторов на поверхности клетки-хозяина, которые отвечают за первоначальную адгезию и инвазию.

Поверхность тахизоитов Neospora caninum значительно отличается от поверхности T. gondii по содержанию поверхностных углеводов, а также по взаимодействию с органеллами хозяина и поглощению питательных веществ.

Когда паразит попадает в организм хозяина, он запускает метаболические процессы, которые способствуют его выживанию. Оба вида паразитов реорганизуют микротрубочки цитоскелета хозяина и привлекают к своей паразитической вакуоли (PV) эндоплазматический ретикулум, митохондрии, лизосомы, мультивезикулярные тельца (временные накопительные структуры, богатые сфинголипидами и холестерином, которые образуются на пересечении эндоцитарного и экзоцитарного путей) и везикулы Гольджи. Однако, в случае с N. caninum, эндоплазматический ретикулум хозяина не соединяется с вакуолярной мембраной, а собирается вокруг неё. Паразит окружает аппарат Гольджи хозяина своей PV, но вызывает меньшую фрагментацию на министопки, чем T. gondii.

Исходя из этих изменений, паразиты собирают холестерин из органелл, хранят его в липидных телах и извлекают сфинголипиды из везикул Гольджи хозяина, изолируя их в своей PV.; Они также привлекают митохондрии хозяина к своей плазматической мембране (PV), удерживают их рядом с этой мембраной и используют митохондрии хозяина для получения энергии в своих целях. Оба паразита манипулируют клеткой-хозяином и пользуются ресурсами млекопитающих. Эти процессы высоко консервативны у обоих паразитов.

Чтобы избежать иммунного ответа хозяина, паразит должен проникнуть в его клетку. Одним из защитных механизмов, которые использует организм, является CD8+ Т-клеточный ответ.

Джордан и Хантер отмечают, что популяция CD8+ Т-клеток играет ключевую роль в защите хозяина при инфекциях, вызванных простейшими апикомплексами. Эти клетки могут функционировать как цитотоксические Т-лимфоциты или секретировать цитокины.

На формирование ответа CD8+ Т-клеток оказывают влияние множество факторов, включая цитокины IL-2 и IL-12. Эти цитокины способствуют увеличению численности Т-клеток, их выживанию и приобретению эффекторных функций.

Хорошо известно, что CD8+ Т-клетки играют важную роль в защите хозяина от инфекции T. gondii. Однако недавно Correia и коллеги обратили внимание на то, что продукция IFNγ также является основным механизмом защиты, обеспечиваемым CD8+ Т-клетками в ходе неоспороза, подобно тому, как это происходит при токсоплазмозе. Этот ответ, наряду с гуморальным иммунным ответом, способствует сдерживанию инфекции.

В случае кишечной формы заболевания может наблюдаться скрытый период, который длится 5–8 дней после того, как тканевые кисты попадают в организм. Однако мало что известно о том, где именно локализуются кисты в органах или какие структуры поражаются.

Neospora caninum способен вызывать некротические поражения, которые становятся заметны уже через несколько дней. Он приводит к гибели клеток за счёт активного размножения тахизоитов и может провоцировать нервно-мышечные заболевания у собак и других животных, разрушая большое количество нейрональных клеток — черепных и спинномозговых нервов, которые отвечают за передачу нервных импульсов между клетками.

Клинические признаки и диагностика

В целом, у взрослых и пожилых собак неоспороз протекает бессимптомно. Однако у молодых собак, возрастом до 6 месяцев, наблюдаются более тяжелые и частые инфекции.

Клинические признаки неоспороза схожи с токсоплазмозом, но в основном проявляются в виде неврологических и мышечных аномалий, таких как паралич передних конечностей. У щенков младшего возраста клинические признаки обычно наблюдаются в возрасте от 3 до 9 недель.

Атрофия передних конечностей и постепенное затвердевание мышц являются наиболее важными клиническими симптомами, которые отличают неоспороз от других заболеваний, вызывающих паралич. Тем не менее, задние конечности страдают сильнее, чем передние.

Паралич прогрессирует, вызывая ригидную контрактуру мышц пораженных конечностей. Этот артрогрипоз приводит к образованию рубцов на мышцах из-за повреждения нижнего двигательного нейрона и миозита. У некоторых щенков наблюдается деформация суставов и искривление конечностей (genu recurvatum), за которыми следуют слабость шейки матки, затруднённое глотание, расширение пищевода и, в конечном итоге, смерть. Эти собаки испытывают тревогу, паралич и нуждаются в особом уходе на протяжении нескольких месяцев.

У молодых щенков также могут возникать серьёзные проблемы со здоровьем, такие как тяжёлая диарея, нарушение координации, многочисленные воспаления в лёгких и некроз тканей (некротическая и гнойная бронхопневмония), а также фибриногеморрагический энтерит (атрофия ворсинок и гиперплазия крипт в тощей и подвздошной кишках). Кроме того, могут развиться миокардит и негнойный энцефалит.

У собак старше шести месяцев заболевание может возникнуть из-за возобновления скрытой хронической инфекции. У взрослых собак обычно проявляется полимиозит и/или менингоэнцефаломиелит, которые вызывают симптомы, связанные с множественными поражениями центральной нервной системы, особенно в области мозжечка.

Реже, но могут возникать такие симптомы, как миокардит, дерматит, пневмония, диффузный перитонит с выпотом в брюшную полость и мультифокальная диссеминация, что обусловлено более широкой распространением тахизоитов.

У таких собак могут наблюдаться следующие симптомы: атаксия, головокружение, наклон головы, нистагм, гиперметрия, тремор головы, замедленные реакции, аномальная работа черепных нервов, анизокория, снижение сегментарных рефлексов, тетрапарез, повышенная чувствительность в области шеи и судороги.

В хронической стадии у большинства животных заболевание протекает бессимптомно. Однако у самок во время беременности может наблюдаться иммуносупрессия, что может привести к реактивации инфекции. Таким образом, брадизоиты, изменив свою форму, превращаются в тахизоиты, проникают через плаценту и заражают плод.

У буйволов это заболевание встречается редко, но были зарегистрированы случаи абортов у животных, контактировавших с собаками, с частотой 60,3%. Это подчеркивает важную роль собак в распространении неоспороза среди продуктивных животных.

Неоспороз следует учитывать при клиническом обследовании, если наблюдаются гиперестезия, отек мышц или атрофия. Собаки любого возраста могут умереть от воспаления центральной нервной системы или мышц. Неврологические расстройства у собак могут иметь множество причин, и неоспороз должен быть одним из дифференциальных диагнозов.

Сообщалось о случаях очаговых поражений в головном и спинном мозге у 6-летних собак с тяжелой инфильтрацией мононуклеарных клеток (большое количество Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов, а также небольшое количество макрофагов) нервных корешков конского хвоста и поясничных нервных корешков. Также были зарегистрированы некротизирующий церебеллит и гепатит.

Эпидемиологический анамнез и клинические данные могут быть полезны для диагностики неоспороза, а также для контроля и профилактики этого заболевания. Результаты общего анализа крови и биохимического анализа сыворотки также дают основания предполагать наличие инфекции, однако не могут служить подтверждением.

Общий анализ крови может выглядеть нормально, с легкой нерегенеративной анемией, легкой эозинофилией или моноцитозом. Большинство ядросодержащих клеток представляют собой неизмененные или слабо измененные нейтрофилы.

Миозит может проявляться в виде высоких значений аланинаминотрансферазы, а также гиперглобулинемии. В спинномозговой жидкости может наблюдаться более 1000 ядерных клеток на микролитр, а концентрация белка также может быть увеличена.

Визуальная диагностика также может быть полезна для оценки степени поражения. К таким методам относятся рентгенография, которая может выявить диффузный интерстициальный рисунок у собак с пневмонией, а также магнитно-резонансная томография и ультразвуковое исследование, которые могут показать мозжечковую атрофию у собак с мозжечковыми симптомами, хотя их вклад в диагностику ограничен.

Не было обнаружено патогномоничных признаков, которые однозначно указывали бы на неоспороз.

Обнаружение паразитов прямыми и косвенными методами имеет важное значение для диагностики и прогнозирования заболевания, а также для профилактики и контроля инфекции в городских, сельских и диких районах. Современные методы позволяют клиницистам и исследователям углубить знания о классической и молекулярной эпидемиологии и патогенезе заболевания. Они также могут оценить эффективность доступных и будущих препаратов, которые используются для лечения клинических признаков, и принять меры по предотвращению распространения паразита.

Прямые методы диагностики предполагают визуальное обнаружение ооцист, тканевых кист или тахизоитов, как окрашенных, так и неокрашенных, с помощью следующих подходов:

• Световая микроскопия;
• Гистопатология;
• Иммуногистохимия;
• Культура клеток in vitro;
• Выделение in vivo с использованием биоанализа песчанок и/или мышей;
• Фекальная флотация фекалий собак;
• Молекулярные методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР).

Каждый из этих тестов может предоставить уникальную информацию, которая недоступна при использовании других методов. Например, гистопатология и иммуногистохимия позволяют оценить масштаб и тяжесть поражения тканей, в то время как молекулярные методы могут просто обнаружить наличие или отсутствие ДНК паразита и определить его количество.

Предел обнаружения, чувствительность, специфичность, а также положительные и отрицательные прогностические значения каждого теста играют ключевую роль в стандартизации. Они крайне важны для создания точного диагностического инструмента, который будет использоваться в повседневной практике.

Световая микроскопия — это наиболее доступный и быстрый метод, который может применяться клиницистами. Однако он имеет ограниченную чувствительность и требует опыта в определении инфекционных стадий паразита. Неправильная интерпретация результатов может привести к ложному диагнозу другого вида апикомплекса.

Клеточная культура и заражение песчанок или мышей позволяют выделить паразита, но для его идентификации необходимо подтвердить результаты с помощью другого, более специфичного метода. Оба метода изоляции требуют значительных усилий и наличия квалифицированного технического персонала для работы с животными или клеточными линиями в условиях строгой изоляции, чтобы избежать перекрестного заражения. Кроме того, для обеспечения этических норм содержания животных и клеток необходима специальная инфраструктура, что значительно увеличивает расходы.

Одним из существенных недостатков обоих методов является ограниченный предел обнаружения. Выделение паразитов из образцов с низкой паразитарной нагрузкой или с авирулентными или менее вирулентными штаммами может быть затруднено, в зависимости от специфики образца. Даже в случае успешного выделения, для получения результатов может потребоваться как минимум 20–30 дней.

Фекальная флотация с использованием растворов сахара или сульфата цинка — это лучший метод выделения ооцист Neospora caninum из фекалий собак. Однако этот процесс требует больших усилий и занимает некоторое время.

Ещё одним ограничением данной методики является то, что собаки с клиническими признаками не выделяют ооцисты, что может привести к негативным результатам. Несмотря на это, данный метод имеет высокую эпидемиологическую ценность. Его стоимость невысока, но его клиническая значимость для врачей ограничена.

Гистопатология и иммуногистохимия настоятельно рекомендуются при репродуктивных проблемах, таких как аборты и поражения плода. Эти методы используются вместе с молекулярными. Их чувствительность и специфичность зависят от качества мишени, антител, микроскопа и опытного лаборанта, который сможет дать точную оценку и сделать заключение. Стоимость этих методов обычно выше, чем у ранее описанных, но результаты являются более убедительными в отношении степени и тяжести поражения.

Молекулярные методы считаются самыми чувствительными и специфичными, но они также обладают определённой долей погрешности. Чувствительность и точность этих тестов зависят от многих факторов, таких как стандартизация методики, тип образца, стадия инфекции, место локализации и качество реагентов.

Хорошо стандартизированная методология может обнаружить даже одну копию ДНК, присутствующую в образце. Однако, если в процессе возникают какие-либо проблемы, паразита может быть сложно выявить или диагностика инфекции N. caninum может быть ошибочной.

В подтверждение этих слов, ван Маанен и его коллеги в ходе межлабораторного сравнения в Европе обнаружили, что большинство показателей иммуногистохимии и ПЦР (как одиночных, так и гнездовых) в тканях плода крупного рогатого скота не соответствуют друг другу. В некоторых случаях ПЦР-тесты давали ложноположительные результаты, что могло быть связано с проблемами загрязнения.

Авторы исследования считают, что проблема может быть решена путём оптимизации методов экстракции ДНК, что позволит повысить эффективность теста. Таким образом, контроль качества является ключевым аспектом при выборе тестов или лабораторий для работы с образцами. Хотя контроль качества может быть дорогостоящим, он значительно повышает точность результатов.

С другой стороны, в исследованиях Baszler et al. и Sanchez et al. было зафиксировано 97% и 85% соответствия между результатами иммуногистохимии и тщательно стандартизированного протокола ПЦР в отношении тканей головного мозга плодов крупного рогатого скота, предварительно обработанных формалином и парафином. Также было выявлено 88% согласованности при работе со свежими тканями.

Молекулярные методы, такие как ДНК-анализ, открывают широкий спектр возможностей. Они позволяют измерять паразитарную нагрузку, обнаруживать паразитов в очень низких концентрациях, исследовать эволюцию паразита в популяции, анализировать вероятность обнаружения паразитов по сравнению с другими регионами и характеризовать изоляты.

Для этого были разработаны различные методологии, включая количественную ПЦР в реальном времени, ПЦР на основе полиморфизма случайной длины фрагмента и мультилокусное микросателлитное типирование с использованием десяти микросателлитов для молекулярного генотипирования. Благодаря этому Campero et al. смогли идентифицировать изолят NC-Argentina LP1 как уникальный генетический образец, отличающийся от всех известных изолятов.

В отличие от прямых методов, непрямые методы включают серологические тесты, такие как иммуноблоттинг, которые выявляют антитела в организме хозяина, косвенно реагирующие на заражение паразитами.

Рутинная антемортемная диагностика обычно проводится на основе серологических исследований, поскольку микроорганизмы не так легко обнаружить с помощью цитологических методов, таких как окрашивание Романовским или использование неокрашенных слайдов. Кроме того, даже если их удаётся обнаружить, они могут быть ошибочно диагностированы как другие апикомплексные паразиты, такие как Toxoplasma gondii или Hammondia heydorni.

Ограничения серологической экспертизы связаны с особенностями физиологии заболевания. Обычно для выявления уровня антител требуется 2–3 недели после заражения. Тем не менее, исследование антител настоятельно рекомендуется для скрининга инфекции в популяции, особенно в стадах, а также для анализа реакции иммунной системы у отдельных пациентов.

Наличие антител N. caninum в образцах сыворотки крови подтверждает факт контакта с паразитом, но не наличие болезни. У собак с острым, а не хроническим инфекционным процессом, можно выявить повышение титров антител. Обычно в течение 15–30 дней при парной серологии наблюдается четырёхкратное увеличение титров.

Как правило, у собак, которые выделяют ооцисты, антитела не обнаруживаются.

Тест на непрямые флуоресцентные антитела (IFAT), тест на агглютинацию неоспоры и иммуноферментный анализ (ИФА) — это наиболее распространенные методы, используемые для выявления антител к N. caninum.

IFAT был первым серологическим тестом, который стал широко применяться для диагностики инфекции у собак. Этот тест считается «золотым стандартом» и используется в эпидемиологических исследованиях, как домашних, так и диких животных.

ИФА и IFAT обычно применяются для выявления инфекции N. caninum у взрослых животных и целых стад. Оба эти метода считаются взаимодополняющими в диагностике неоспороза.

Вестерн-блоттинг обычно рекомендуется для подтверждения неопределённых результатов в ценных образцах. Кроме того, тесты на авидность могут быть полезны для изучения путей передачи N. caninum в стадах при различных острых и хронических инфекциях. Кроме того, эффективность тестов (чувствительность, специфичность, положительные и отрицательные прогностические значения) может различаться в разных лабораториях. Затраты на проведение тестов напрямую зависят от их качества. Обычно стоимость одного теста или повторного тестирования невелика, но она может значительно возрасти, если речь идёт о периодическом контроле в больших стадах или при работе с большим количеством животных.

Alvarez-Garcia и другие исследователи сравнили десять коммерческих косвенных или конкурентных иммуноферментных анализов (ИФА) на выявление неоспороза крупного рогатого скота. Результаты показали высокую чувствительность — от 95,8% до 100%, за исключением теста IDEXX rum iELISA с чувствительностью 85,9%. Также была выявлена высокая специфичность — от 93% до 100%, кроме теста VMRD cELISA с чувствительностью 65%.

При этом все тесты продемонстрировали почти полное совпадение (80–90%), что подтверждает эффективность использования ИФА. Как отмечают Campero и другие, сравнение ИФА с иммуноблоттингом (который считается относительным стандартом) и с ИФА р38 (97%) показало чувствительность 97,8% и специфичность 99,5%.

Björkman и другие исследователи наблюдали умеренное или значительное совпадение между четырьмя европейскими лабораториями, использующими тесты ИФА IgG-avidity для дифференциации острого и хронического неоспороза у крупного рогатого скота.

Waldner и другие исследователи зафиксировали хорошее совпадение (76%) между двумя коммерческими наборами ИФА, что выше, чем при сравнении каждого теста с коммерческим тестом прямой агглютинации (46% и 60%).

Таким образом, лабораторные исследования играют ключевую роль в диагностике инфекций и заболеваний. Однако, чтобы обеспечить эффективное лечение каждого животного и принять надлежащие меры по профилактике и контролю инфекции, лабораторные данные должны быть тесно связаны с клиническими проявлениями.

Эпидемиологическая, молекулярная и физиопатологическая информация, полученная в ходе рутинных тестов и исследований, поможет углубить наши знания о природе заболевания, взаимодействии между хозяином и паразитом, а также о влиянии окружающей среды на развитие болезни.

Лечение, профилактика

Лечение неоспороза, как правило, представляет собой сложный процесс и может быть временно неэффективным или же вовсе не дать результата. Нередко требуются длительные курсы лечения, превышающие 8 недель.

У собак с неврологическими проявлениями неоспороза лечение может быть особенно длительным и иметь неблагоприятный прогноз. Наиболее эффективным оно оказывается на ранних стадиях, до того, как развиваются мышечные контрактуры. При кожных формах неоспороза лечение, по-видимому, более результативно.

Основным препаратом для лечения неоспороза у собак является клиндамицин — единственный линкозамид, обладающий дополнительной противопротозойной активностью. Благодаря этому он эффективен против тахизоитов Neospora caninum.

Комбинация клиндамицина и сульфаниламида демонстрирует высокую эффективность в борьбе с неоспорозом. Кроме того, синергическое действие сульфаниламидов и пириметамина усиливает антипротозойные свойства.

Клиндамицин влияет на размножение тахизоитов N. caninum, но считается, что он оказывает незначительное или вовсе не влияет на брадизоиты. Таким образом, даже после двух месяцев лечения, тканевые кисты могут оставаться. Поэтому стоит рассмотреть возможность лечения хронического неоспороза, воздействуя на брадизоиты с помощью иммунного ответа.

В целом, большинство протоколов лечения неоспороза направлены на облегчение клинических симптомов, а не на полное уничтожение паразитов. Среди наиболее распространенных подходов можно выделить следующие:

• Клиндамицин: перорально или подкожно по 7,5–15 мг на килограмм веса каждые 8 часов в течение 4–8 недель.
• Триметоприм-сульфаниламид: перорально по 15–20 мг на килограмм каждые 12 часов в течение 4–8 недель.
• Пириметамин-сульфаниламид: перорально по 5–30 мг на килограмм каждые 12 часов в течение 4–8 недель.

Кроме того, Сайкс предлагает другие схемы лечения, которые включают те же препараты, но с различными дозами и интервалами. Например, можно использовать клиндамицин в дозе 10–12 мг на килограмм перорально каждые 8 часов в течение 4 недель, триметоприм-сульфаниламид в дозе 15 мг на килограмм перорально каждые 12 часов в течение 4 недель, пириметамин в дозе 1 мг на килограмм перорально каждые 24 часа в течение 4 недель или поназурил в дозе 20 мг на килограмм перорально каждые 24 часа на протяжении 4 недель. Лечение следует продолжать до тех пор, пока не наступит клиническое улучшение.

Если в помете обнаруживается щенок, больной неоспорозом, то все остальные щенки должны быть проверены на наличие антител к N. caninum. Если тест окажется положительным, то таких щенков необходимо пролечить. Важно не использовать иммуносупрессивные препараты для лечения серопозитивных щенков.

Паразит может многократно передаваться от инфицированной самки к её потомству, поскольку профилактическое лечение недоступно. Поэтому важно предотвратить возможность заражения.

Собаки не должны иметь доступа к материалам плаценты крупного рогатого скота, мертвым телятам, плодным оболочкам, абортированным плодам или сырому/недоваренному мясу. Также важно, чтобы собаки не испражнялись в присутствии домашнего скота. Кроме того, следует избегать контакта с инфицированными тканями других промежуточных хозяев, таких как овцы, козы и лошади, а также с фекалиями других домашних и диких псовых, включая койотов и австралийских динго.

Препятствуйте хищничеству. Не позволяйте собакам испражняться в кормушках, пить из фонтанов, источников воды, пастбищ и загонов.

В настоящее время не существует доступных эффективных вакцин, способных защитить восприимчивых животных и предотвратить заражение. Однако, несмотря на это, были предприняты определённые усилия и исследования в области разработки вакцин для собак и крупного рогатого скота.

Одним из ключевых препятствий на пути создания вакцины против N. caninum является потенциальная опасность иммунного ответа для плода. Исследования в этой области ведутся уже давно, и большинство подходов сосредоточены на следующих вариантах:

• Инактивированные цельные вакцины, представляющие собой убитые тахизоиты.
• Нативные субъединицы, такие как вакцина на основе экстракта тахизоита, содержащая соевый лецитин и адъювант β-глюкан.
• Рекомбинантные антигены N. caninum.
• Живые, но естественно ослабленные паразиты.

Исследования начались с применения сырого лизата паразита, чтобы предотвратить заражение потомства. Затем вакцина была опробована на крупном рогатом скоте, и в продажу поступила зарегистрированная вакцина против N. caninum (NeoGuard™). Однако ее эффективность оказалась низкой — менее 25%.

В то же время, живые вакцины продемонстрировали более высокую эффективность — до 100% при экспериментальных инфекциях. Они вызывали сильные клеточные и IFNγ ответы, которые коррелировали с защитой от фетопатии. Однако иммунизация лизатом цельного тахизоита с различными адъювантами не смогла предотвратить гибель плода.

Была испытана профилактическая вакцина, созданная на основе рекомбинантного вируса герпеса собак. Она содержит поверхностный белок N. caninum (NcSRS2), который идентичен аутентичному белку паразита для собак и крупного рогатого скота.

В ходе испытаний Nishikawa et al. обнаружили, что у иммунизированных собак вырабатываются антитела N. caninum IgG, но при этом не возникает никаких клинических симптомов. У этих собак не был выявлен инфекционный герпесвирус.

В свою очередь, Staska et al. выявили паразитоспецифичные CD4+ Т-лимфоциты и ответ IFNγ у экспериментально инфицированного крупного рогатого скота. Эти результаты подтверждают необходимость дальнейшего изучения вакцин, содержащих генные последовательности или пептиды NcSRS2. Однако, несмотря на хорошие результаты, никаких дополнительных исследований не проводилось.

В исследовании, проведённом на мышах C57BL/6, Ramamoorthy и его коллеги обнаружили, что ослабленная γ-облучённая тахизоитная вакцина N. caninum обеспечивает защиту. Ни у одной из вакцинированных мышей не проявилось никаких клинических симптомов до конца эксперимента, однако было отмечено значительное повышение уровня секретируемых интерферонов (IFNγ), интерлейкинов (IL-10), иммуноглобулинов (IgG1 и IgG2a), а также небольшое количество IL-4.

Хотя эта вакцина может стать эффективным средством для предотвращения вертикальной передачи инфекции у крупного рогатого скота, есть существенный недостаток: облучённые тахизоиты, возможно, не сохраняются в организме хозяина так же долго, как живая вакцина. Это означает, что потребуется повторная иммунизация.

Кроме того, подходы, основанные на диоксиде кремния, открывают новые горизонты для прогнозирования эффективности вакцин-кандидатов и должны быть использованы. Важнейшим аспектом является определение точных белковых мишеней, которые, возможно, станут ключевым фактором, определяющим успех или неудачу этого подхода. То же самое касается и препаратов, предотвращающих трансплацентарную передачу, и новые исследования в этих областях необходимы.

Перевод — Оригинал статьи